I-153 tham chiến lần đầu vào năm 1939 trong Trận Khalkhin Gol giữa Liên Xô-Nhật Bản tại Mông Cổ. Máy bay tiêm kích Kiểu 97 (Nakajima Ki-27) của Nhật đã chứng minh mình là một đối thủ đáng ghờm cho I-15bis và I-16, nhưng chỉ ngang bằng với I-153 do nó có độ cơ động cố hữu vốn có của các máy bay hai tầng cánh trong khi hiệu suất được cải tiến. Trong khi toàn bộ hiệu suất của I-153 tỏ ra ổn định, thì một số vấn đề quan trọng đã bộc lộ. Khó khăn nhất là vật liệu ngăn cách giữa thùng nhiên liệu phía trước buồng lái và phi công. Kết hợp với lực kéo mạnh đi xuyên qua những bánh xe dưới phi công, thùng nhiên liệu một khi cháy sẽ nhanh chóng phá hủy buồng lái giết chết phi công. Thêm vào nữa, động cơ M-62 có tuổi thọ sử dụng thấp khoảng 60-80 giờ do những hỏng hóc ở hai bộ phận bơm tăng nạp.

Cuộc thanh trừng vĩ đại của Stalin diễn ra vào thập niên 1930 đã dẫn đến một loạt những nhà khoa học lớn của Liên Xô phải chịu án tù khổ sai, trong đó có các công trình sư thiết kế máy bay, dẫn đến thiếu hụt những máy bay hiện đại trong lực lượng không quân Xô viết (VVS) khi bắt đầu Chiến tranh Thế giới II. Dù những máy bay tiêm kích đời mới như Yak-1 và LaGG-3 đang được sản xuất, vào 22 tháng 6-1941, thời điểm quân Đức tấn công Liên Xô, phần lớn trang bị máy bay của VVS là những máy bay lỗi thời được thiết kế trong thập niên 1930, bao gồm một lượng lớn I-153. Ngay cả vào cuối năm 1942, đã có những nỗ lực để phục hồi sản xuất I-153 và I-16 để lấp đầy sự thiếu hụt những máy bay tiêm kích.

Polikarpov I-153 chưa bao giờ phục vụ trong bất kỳ đơn vị Không quân Tây Ban Nha nào trong hoặc sau cuộc Nội chiến Tây Ban Nha. Hai phương án trước đó của I-153 là I-15 và I-15bis đã phục vụ trong Không quân lực lượng Cộng hòa trong thời gian xung đột và sau đó bị chiếm, cả hai kiểu này đều được sử dụng bởi Fuerzas Aereas đến tận những năm 1950.